ANALISI TOSSICOLOGICHE

(per esempio:PUROMICINA:cellule glomerulari;CLOROFORMIO:cellule tubulari)

-visione di cellule distorte,vacuolizzate,necrotiche

-dà poche informazioni sui meccanismi.

SONO TECNICHE "PER IMMAGINI".

MICROSCOPIA ELETTRONICA

ha un potere di risoluzione più alto e si possono vedere gli ORGANELLI.Possiamo avere l'immagine di un macrofago che fagocita le fibre.E' possibile evidenziare un danno a livello subcellulare prima che lo stesso si manifesti.

Esempio:

TETRACLORURO DI CARBONIO:si forma il radicali CCl3 che viene ossidato dal citocromo P450 che porta a tossicità;questo avviene a livello del reticolo endoplasmatico delle cellule epatiche che si rigonfiano.

E' una tecnica molto costosa,quindi non può essere di routine.

-localizzare il danno a livello subcellulare

(esmpio:CCl4 dà dilatazione del reticolo endoplamatico)

-tecnica costosa e complessa.

REAZIONI CITICHIMICHE

-reazione chimica condottas su di un tessuto o su una cellula isolata.

-il prodotto di reazione si localizza in prossimità di dove avviene la reazione.

-visione di insieme del tessuto.

-valutazione dell'estensione del danno.

-individua le cellule danneggiate.

-individua gli organuli danneggiati.

-quantifica il danno. (si dà un parametro oggettivo e si trova le relazione dose/danno e tempo/danno)

Il tessuto deve essere opportunamente preparato e colorato.

Sono di due tipi:

-CITOCHIMICA ENZIMATICA:tessuti congelati.E' rivolta ad evidenziare gli enzimi cellulari che sono,perlopiù,enzimi di membrana.Se facciamo opportunamente reagire un marker con questi enzimi,il prodotto di questa reazione è colorato,che poi vedremo al microscopio ottico.

(assenza di LH:metodo al NITROBLUTRAZOLO e accumulo di Ca++ :metodo al ROSSO ALIZARINA).

Si opera a temperature basse.

-IMMUNOISTOCHIMICA:tessuti fissati in formalina.Poi viene opportunamente lavorato.

-ASSENZA DI LH

Si ricerca spesso la lattato deidrogenasi che si trova all'interno della cellula.Quando la cellula muore il contenuto esce e si perde l'enzima.

-ACCUMULO DI CA++

Il Ca++ è un rivelatore di fenomeni tossici,soprattutto se aumenta.nei bordi esterni della cellula,il Ca++  è poco visibile.E'possibile quantificare il danno con programmi computerizzati.

-PRESENZA DI SUCCINATO-DIEDROGENASI (Su-DH)

La Su-DH è un enzima a livello mitocondriale.Ci sono vari livelli di danno.Si vede l'attività enzimatica nella zona danneggiata.I livelli di lattato (enzimi citosolici) con il tempo diminuiscono dopo quattro ore mentre quelli mitocondriali diminuiscono dopo 24 o 48 ore dall'ischemia.

PREPARAZIONE TESSUTO PER IMMUNOISTOCHIMICA

-Fissazione in formalina

-Disidratazione (alcool crescente:50-70-90-assoluto)

-Inclusione di paraffina

-Taglio

-Sezione del vetrino (3-4 micron)

-Sopraffinare:reidratare (alcool decrescente)

-Anticorpo I e II

Esistono anticorpi specifici (anticorpo primario),dopodiché si aggiunge un anticorpo secondario che dà una colorazione:Così possiamo vederla con il microscopio ottico.

METODI IN VITRO

-Colorazioni vitali

a)   TRYPAN BLUE:cellule morte in blu.E'una colorazione estremamente polare.Se la cellula è viva non riesce a penetrare all'interno.

b)   IODURO DI PROPIDIO:specifico per il nucleo.Si lega al DNA e dà una fluorescenza rossa.entra nella cellula morta.

c)   DIACETATO DI FLUORESCEINA:fluorescenza rossa nel citoplasma di cellule vive.

B+c)

-cellula viva:citoplasma verde,nucleo scuro.

-cellula morta:citoplasma scuro,nucleo verde.

-colorazioni funzionali:

-RODAMINA 123:fluorescenza rossa nei mitocondri di cellule vive.

-FURA-2:indicatore del Ca++ intracellulare.(E'un indicatore,entra nella cellula e viene attaccato dalle esterasi e da liofilo diventa idrofilo).

Il fluorimetro misura l'intensità della FLUORESCENZA.