MATERIALI e APPARECCHIATURE:

Polarimetro

Tubi polarimetrici da 1 a 2 dm

Bagno termostatico a 37°C

N^4 palloni tarati da 100 ml

N^1 bagnomaria per provette

N^4 provette

N^2 pipette a siringa da 5 ml

REATTIVI:

Saccarosio

Invertasi o ß-fructosidasi UI=150000/500 mg

Tampone citrato pH 4.66 o tampone acetato pH 5

Soluzione Fehling A e B

Acido cloridrico conc.

NaOH 20%

La soluzione di b-fructosidasi viene preparato dall'enzima liofilizzato

UI= unità internazionale è la quantità di enzima che catalizza la conversione di una micromole (10- moli) di substrato a prodotto in un minuto a 25°C e a pH ottimale.

La temperatura a cui noi lavoreremo con il nostro enzima è 37°C e a pH tamponato a 5.

Attività specifica è il numero di micromoli di substrato usato o di prodotto formatosi in ogni minuto x mg di enzima.

PROCEDIMENTO:

Si sciolgono 10g di saccarosio in un pallone da 100 ml con acqua distillata, si porta a volume e si misura il potere rotatorio a 20°C con il polarimetro.

Si sciolgono ancora 10 g di saccarosio in un pallone da 100 ml con 50 ml di acqua distillata, si aggiungono 5 ml di acido cloridrico concentrato e si mette a bagnomaria per 5 minuti a una temperatura di 65°C, agitando di tanto in tanto. Successivamente si raffredda sotto acqua corrente fredda e si introducono 10 ml di NaOH al 20% per neutralizzare l'acido, si porta a volume e infine si legge al polarimetro.

Si pesano un terzo e un quarto campione di saccarosio da 10 g l'uno, si trasferiscono con un po' d'acqua distillata nei rispettivi palloni da 100mle si aggiunge ad ognuno la quantità di invertasi calcolata, sciolta in un determinato volume di soluzione tampone a pH 5.

Il terzo campione viene messo ad incubare per 15 minuti a 37°C, scaduto il tempo si introduce una soluzione satura di Na CO  5 ml per bloccare l'attività dell'enzima e accentuare la mutarotazione del glucosio, portare a volume e leggere al polarimetro.

Il quarto campione invece che per 15 minuti viene posto ad incubare per 30 minuti a 37°C, per bloccare viene poi introdotto  il Na CO 5ml, viene portato a volume e infine letto al polarimetro.

In tre provette da saggio miscelare 5 gocce di Fehling A e 5 gocce di feeling B e 40 gocce di acqua distillata. Porre a bagnomaria bollente e aggiungervi rispettivamente 10 gocce del campione 1, 5 gocce del campione 2 e 5 gocce del campione 3. La reazione che avviene è la seguente:

CALCOLI:

quantità di enzima necessaria alla trasformare completamente 10 g di saccarosio:

moli saccarosio=10g/(342g/mole)= 0.0292moli ---> micromoli

500:150000=x:3*10

x=100mg di enzima necessari per convertire in un minuto 10 g di saccarosio

noi però prendiamo in considerazione non un minuto ma 30 minuti, in quanto la nostra prova avrà tale durata, quindi:

moli saccarosio: 3*10 micromoli/30'= 1000micromoli (circa)

500:150000=x:1000

x 3mg di enzima necessario a convertire in 30' 10 g di saccarosio.

Quindi dovrei pesare 0.003 g di enzima il che mi risulterebbe difficile e quindi preferisco pesare 0.03g e portare a 100cc in un matraccio ottenendo una soluzione 10 volte più concentrata di quella che dovrei avere.

Di questa soluzione prelevo 10 cc che diluisco ulteriormente per ritrovarmi alle condizioni iniziali, la soluzione ora contiene 0.003g di enzima.

RACCOLTA DATI:

saccarosio