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PROCEDURA DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI BIOLOGICI PER L'OSSERVAZIONE AL SEM

biologia


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PROCEDURA DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI BIOLOGICI PER L'OSSERVAZIONE AL SEM

PROCEDURA DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI

BIOLOGICI PER L'OSSERVAZIONE AL SEM

3.1 Fissazione

Lo scopo è lo stesso visto per il TEM (vedi par.1.1).

E' stata utilizzata glutaraldeide al 2,5% in Tyrode 0,1 M a pH 7,3. La fissazione può essere ottimizzata con l'uso di OsO4 a basse concentrazioni.



 

3.2 Disidratazione

Lo scopo e le modalità di esecuzione sono gli stessi visti nel paragrafo 1.2 con la differenz 323h77d a che i passaggi sono più lunghi e viene saltato il passaggio in OP.

3.3 Critical point drying (CPD)

Prima di procedere all'osservazione col SEM, è necessaria la rimozione dell'alcool presente nel campione dopo la sua disidratazione.

Un metodo valido ed economico è il CPD, che però presenta alcuni svantaggi: l'alta pressione che bisogna raggiungere, la necessità di volatilizzare il fluido intermedio (alcool) e l'occasionale congelamento della valvola di scappamento. Per questo motivo bisogna stare vicini alla macchina nel momento in cui si raggiungono le alte pressioni.

Il punto critico è quella condizione di temperatura e pressione, alla quale sono eliminate le tensioni superficiali delle molecole di un fluido, e non si riesce più a distinguere la fase liquida da quella gassosa. Esso è un valore proprio di ogni liquido (compresi i gas condensati), tra i quali i più usati sono la CO2, l'N2O e alcuni freons. Nel nostro caso è stata utilizzata la CO2 (punto critico a 31°C e 73 atm) che però non è miscibile direttamente in acqua e necessita quindi di alcool etilico come fluido intermedio. In altre parole per la disidratazione del campione bisogna usare prima gli alcoli (fluidi intermedi) per togliere l'acqua, e poi la CO2 liquida per eliminare l'alcool; per evitare che le tensioni superficiali fra aria e alcool durante l'evaporazione di quest'ultimo deteriorino il campione, si utilizza il metodo del CPD, che assicura una disidratazione delicata. Il campione viene introdotto in una camera a tenuta di pressione, e successivamente ricoperto di CO2 liquida. Si eseguono tre o quattro lavaggi con la CO2 mantenendo la temperatura tra i 4°C e i 12°C; quando tale temperatura viene superata, si fa passare un gas refrigerante in una serpentina per ottenere il raffreddamento. Alla fine dei lavaggi viene accesa la resistenza che provvede al riscaldamento della camera, e si imposta il termostato a 45°C.; raggiunta tale temperatura la pressione è di circa 100 atm, e si può ora giungere al CPD: tenendo aperta la valvola di sfiatamento la pressione diminuisce lentamente fino ad arrivare al valore standard di 1 atm, la CO2 fuoriesce senza rovinare il campione e dopo 2 ore è tutta evaporata. Il campione, completamente disidratato, viene così "incollato" su un supporto di metallo tramite una pasta d'argento che ha la funzione di condurre a terra gli elettroni incidenti durante l'osservazione al SEM.

3.4 Metallizzazione




Con tale processo si intende la copertura della superficie del      campione con una pellicola d'oro, che ha la funzione di riflettere gli elettroni prodotti dal filamento del microscopio.

Si utilizza uno strumento costituito da una camera cilindrica con al centro un supporto per i campioni e un elettrodo d'oro.

Un flusso di argon proveniente da una bombola esterna serve inizialmente a pulire le pareti interne della macchina, ma soprattutto, infrangendosi successivamente contro la superficie dell'elettrodo in tensione, causa il distaccamento di alcune particelle di oro che quindi cadono e si fissano sul campione.

4 MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE (SEM)

4.1 Funzionamento del SEM

Analogamente al TEM un filamento di tungsteno produce un fascio di elettroni che passando attraverso varie lenti magnetiche  si dirige verso il campione. La differenza sta nel fatto che mentre con il TEM si ha un'immagine formata dagli elettroni primari, con il SEM la formazione dell'immagine avviene tramite gli elettroni secondari: gli elettroni che colpiscono il campione vengono riflessi con diverse angolazioni, in maniera dipendente dalla morfologia della sua superficie. Il rivelatore è costituito da un fotomoltiplicatore il cui segnale viene elaborato dal computer. L'immagine è tridimensionale e la risoluzione è di 25 Angstrom [Fig.2].







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