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Sistema del GMPc - Caratteristiche delle due forme di guanilato ciclasi

medicina




Sistema del GMPc



Il GMPc è un secondo messaggero intracellulare. Si forma a partire dal GTP per azione della guanilato ciclasi. Di questo enzima esistono due forme: una è la forma citoplasmatica ed è attivata da un mediatore particolare che è l'NO. La sintesi dell'NO è a sua volta stimolata da Ach, serotonina, istamina, bradichinina, sostanza P e glutammato. L'altra è localizzata sulla membrana cellulare ed è attivata da trasmettitori come il peptide natriuretico atriale, l'ACTH e altri NT. I recettori coinvolti sono direttamente associati a questo enzima e non c'è la proteina G intermedia.



Acetilcolina ----------- NO ------------- guanilato ciclasi ----------- cGMP



Serotonina citoplasmatica

Istamina

Bradichinina

Sostanza P

Glutammato


Fattore natriuretico atriale -------- guanilato ciclasi

ACTH della membrana

Altri NT plasmatica




La guanilato ciclasi del citoplasma è diffusa un po' ovunque, ed è abbondante nei polmoni, nel cervelletto, nel cervello. Il discorso è analogo per quella di membrana.

La struttura della prima è un eterodimero (composta da più subunità), mentre la seconda è un monomero.

La guanilato ciclasi citoplasmatica contiene anche un gruppo eme, che è il gruppo che lega l'NO, mentre la forma di membrana è attivata dal legame di peptidi a livelli della membrana plasmatica.

Con i siti di binding del GTP non c'è cooperatività per la guanilato ciclasi citoplasmatica, ma c'è invece per la forma di membrana: quando c'è una cooperatività positiva significa che il primo legame con la molecola facilita il legame con le molecole che vengono dopo (avviene un aumento dell'affinità per il legame delle molecole successive; tutto ciò è possibile per il fatto che ci sono più siti di legame per il GTP), mentre se non c'è cooperatività vuol dire che il modo di legare il GTP rimane sempre lo stesso.

La forma citoplasmatica è attivata da questo messaggero diffusibile che è l'NO, mentre la forma di membrana è attivata dal legame di peptidi sulle membrane cellulari.

L'effetto dell'ATP è una lenta inibizione sulla forma citoplasmatica, mentre sulla forma di membrana porta ad attivazione allosterica.

La guanilato ciclasi più interessante tra le due è quella citoplasmatica.




Caratteristiche delle due forme di guanilato ciclasi




Forma citoplasmatica


Forma di membrana

Molto diffusa (polmoni, cervelletto, cervello.)

Molto diffusa (polmoni, cervelletto, cervello.)

Eterodimero

Monomero

Si attiva legando l'NO tramite il gruppo EME

Si attiva tramite il legame di peptidi alla plasmamembrana

Non c'è cooperatività per il GTP

C'è cooperatività per il GTP

L'ATP porta una lenta inibizione

L'ATP determina attivazione allosterica






SISTEMA DELL'OSSIDO DI AZOTO (NO)




L'NO viene prodotto in una cellula generatrice e poi va ad agire su un'altra cellula che è la cellula bersaglio. Nella cellula generatrice, l'NO si forma a partire dall'L-arginina, che è un aminoacido, per attivazione della NO-sintetasi (tale attivazione avviene grazie all'aumento del Ca intracellulare).



L-arginina ----- ----- ------------- L-citrullina + NO ---------- attivazione della

NO-sintetasi guanilato ciclasi

(attivato dal Ca2+)



Dunque la formazione di questo messaggero dipende dall'attività di un enzima, la NO-sintetasi. L'NO diffonde nella cellula bersaglio posta nelle vicinanze e qui determina l'attivazione della guanilato ciclasi.

Esistono due tipi di NO-sintetasi:


Non inducibile - costitutiva

Sempre presente nel tessuto 

Inducibile

(da parte di LPS, IFN-g, TNF-a, IL1-b)


Presente nell'endotelio, nel tessuto nervoso e nelle piastrine   


E' legato ad una risposta di tipo immunitario; infatti l'NO a dosi elevate diventa una sostanza tossica; lo ritroviamo nelle cellule immunitarie, nelle cellule endoteliali, nelle cellule muscolari lisce, nella microglia, altre


Viene attivato da meccanismi Ca /calmodulina dipendenti


E' Ca /calmodulina indipendente


Rilascia l'NO per brevi periodi (non ha tossicità, perché le quantità rilasciate sono sempre controllate)


Rilascia l'NO per lunghi periodi

N.B.: l'induzione di questo enzima richiede la sintesi de novo della BH4

Monomero


Dimero


Entrambi i tipi di NO-sintetasi sono citosoliche, sono flavoproteine (sia FMN che FAD), usano come cofattore il NADPH, possono essere inibite da analoghi dell'arginina (somministrando analoghi dell'arginina, che si legano all'enzima non permettendogli di agire, possiamo inibire la sintesi dell'NO), presentano un'omologia con la famiglia dei citocromo P450 reduttasi. Inoltre hanno attività di NADPH diaforasi e sono diossigenasi.





EFFETTO DELL'NO - DIPENDENTE DAL SITO DI RILASCIO



Gli effetti dell'NO sono diversi a seconda del sito di rilascio del mediatore stesso. Alcuni effetti dell'NO sono stati studiati, e quello meglio caratterizzato è quello nel quale la cellula generatrice è a livello endoteliale. La sintesi è stimolata dall'Ach, dalla serotonina, dall'istamina, dagli H+, dalla bradichinina, dalla sostanza P, dal glutammato. Sono tutte sostanze che portano ad un aumento del Ca2+ nella cellula endoteliale generatrice. Poi l'NO che si forma diffonde e va ad agire sulla cellula muscolare liscia posta nelle vicinanze, dove, attraverso lo stimolo alla sintesi di guanilato ciclasi, causa rilasciamento portando a vasodilatazione. Molti farmaci usati come vasodilatatori ( nitrati organici), hanno un meccanismo d'azione basato appunto sul rilascio dell'NO. Nella terapia dell'angina si usano farmaci che rilasciano NO.



Nelle piastrine invece l'NO inibisce l'aggregazione e l'adesione.

Nel SNC, invece, il sistema maggiormente studiato è quello presente nel cervelletto. In questo caso l'NO-sintetasi è attivato dal Ca2+ che entra nella cellula grazie ai recettori NMDA, che sono recettori-canale permeabili a Na+ e Ca2+ attivati da aminoacidi eccitatori, come il glutammato. L'NO così formato nella cellula post-sinaptica è in grado di diffondere e di influenzare la sintesi di guanilato ciclasi. In ciò sono soprattutto coinvolte le funzioni ippocampali. Quindi l'acido glutammico attraverso i suoi recettori NMDA determina l'eccitazione della cellula post-sinaptica favorendo l'entrata del Ca2+; il Ca2+ dopo legame con la calmodulina attiva l'NO-sintetasi che utilizza l'arginina citoplasmatica per dare NO, che è un messaggero diffusibile, e ha due target: uno sugli astrociti (lo vedremo quando parleremo dell'acido glutammico, il cui metabolismo impegna sia la glia che il neurone), l'altro direttamente sul terminale nervoso presinaptico.

L'altro effetto studiato dell'NO è nei macrofagi. L'NO viene formato nei macrofagi da una NO-sintetasi inducibile, viene poi liberato e distrugge le cellule neoplastiche e batteriche, grazie all'effetto citostatico e citotossico.




CANALI IONICI


La trasmissione ionotropa avviene attraverso canali ionici. I canali ionici sono una classe importante di glicoproteine presenti nella membrana cellulare che regolano flussi ionici ai due lati della membrana.

I canali conducono gli ioni a velocità elevata pari a 107 ioni/sec. Questi canali conducono una grande quantità di ioni a differenza delle pompe ioniche (che conducono meno ioni, ma possono lavorare anche contro gradiente; le pompa ioniche trasportano gli ioni attraverso la membrana con consumo di energia) e lavorano sempre con un gradiente ionico favorevole (il flusso di questi ioni va sempre secondo il gradiente elettrochimico dello ione che si sta trasportando); inoltre c'è una selettività di passaggio per ogni canale: ogni canale può far passare ioni specifici.

Ai due lati della membrana cellulare esiste una distribuzione precisa degli ioni, e ciò è molto importante perché è in base ad essa che viene regolata l'eccitabilità della cellula. L'interno della cellula è soprattutto ricco di K+, le cui cariche positive sono bilanciate dagli anioni proteici, mentre all'esterno troviamo il Na+ che è bilanciato dal Cl-. Questa differenza di cariche è importante e viene mantenuta a riposo. Il potenziale della cellula è legato allo ione K+, per cui in questa situazione, con questa distribuzione degli ioni, il potenziale di membrana della cellula risulterà elettronegativo a riposo.


Il Na+ tende ad entrare nella cellula per:

gradiente di concentrazione favorevole;

attrazione da parte di cariche di segno opposto.


Il K+ tende ad uscire dalla cellula per:

gradiente di concentrazione favorevole;

repulsione da parte di cariche uguali.



Durante il potenziale d'azione, la cellula è attivata, da un recettore-canale che apre la strada al primo passaggio di ioni Na+; questo passaggio fa variare il potenziale di membrana e quindi fa aprire anche canali che dipendono dal voltaggio. Quindi entra ancora più Na+. Ma ci sono anche canali di voltaggio che fanno entrare il Ca2+; per cui il Ca2+ contribuisce a mantenere elevato il potenziale di membrana, ma è anche responsabile degli effetti che poi avvengono all'interno della cellula. Il calcio normalmente è presente in quantità elevata nella cellula, ma in forma legata e, quindi, inattiva. Il calcio come ione è in grado di innescare i vari effetti legati al Ca2+ come l'esocitosi, la contrazione muscolare, la secrezione ormonale. Durante questa fase di depolarizzazione, comunque, oltre ai canali del Na+ e del Ca2+ si attivano anche canali voltaggio dipendenti che fanno passare il K+. L'uscita del K+ porta alla ripolarizzazione, ovvero fa diminuire di nuovo il potenziale. Questo però porta ad una eccessiva ripolarizzazione, per cui finisce con l'attivarsi anche una pompa Na+/K+, che ha il compito di condurre fuori il Na+ e di portare dentro il K+. Questa pompa è ovviamente sensibile alle variazioni di concentrazione di questi ioni ai 2 lati della membrana.



Classificazione dei vari canali ionici in base al meccanismo di attivazione


Canali controllati dal voltaggio (Na+, K+, Ca2+, Cl-);

Canali attivati da ligandi, a loro volta classificati in due sottogruppi:

quelli operati da recettore (recettori-canale) e quindi, più propriamente, attivati da un NT, che è presente sul sito localizzato a livello extracellulare del canale, e possono essere eccitatori - per es. quelli degli aminoacidi eccitatori, NMDA e AMPA-kainato (per il glutammato), il recettore nicotinico dell'Ach, il recettore della serotonina; sono attraversati da Na+, K+ e Ca2+ (con alcune eccezioni: per es. i recettori AMPA non sono permeabili al Ca2+) - o inibitori - sono attraversati dal Cl- e sono recettori GABA-A, glicina e istamina della lamina visiva;

quelli regolati da secondi messaggeri intracellulari, da proteine G o da prodotti del metabolismo cellulare);

Canali attivati da stimoli sensoriali.


Dal punto di vista farmacologico ci interessano le prime due classi.




RECETTORI-CANALE: IL RECETTORE COLINERGICO-NICOTINICO


L'Ach non ha solo recettori nicotici (ionotropi), che sono recettori-canale che fanno passare Na+, ma ha anche altri recettori (muscarinici, metabotropi) che sono accoppiati a G proteine; quindi ha due tipi di trasmissione, ionotropa e metabotropa.






Di recettori nicotinici ne esistono diversi tipi:


recettore legato alla placca motrice (farmaci attivi su questo recettore saranno quelli che vanno a bloccarlo, e quindi che portano a un rilasciamento del muscolo scheletrico);

recettore a livello dei gangli; è di tipo neuronale ed è diverso da quello muscolare; è presente anche nella midollare surrenale, e qui attiverà poi la liberazione di NT che fanno l'ultima sinapsi con i vari organi bersaglio, quindi ghiandole ( per es. ghiandole sudoripare), muscoli lisci ( dei vasi); questa seconda sinapsi può portare o recettori colinergici di tipo metabotropo muscarinici, oppure la noradrenalina o la dopamina; per ognuno di questi recettori possiamo avere dei farmaci selettivi utilizzati ai diversi scopi; ovviamente farmaci che agiscono sul recettore nicotinico neuronale saranno estremamente potenti, aspecifici e poco utili.



Recettori nicotinici (nAchR)


Dunque questi recettori nicotinici si dividono in muscolari e neuronali. Ovviamente quelli neuronali non sono presenti soltanto sui gangli o sulle cellule crommafini, ma anche nel SNC. Quelli muscolari sono bloccati da a-bungarotossina e bloccanti curarici (sono tutte sostanze che vengono dal mondo animale; il curaro era usato per avvelenare le frecce che dovevano andare a colpire la preda, esercitando su essa un effetto paralizzante; tuttavia il curaro non aveva tossicità per le persone che si nutrivano degli animali uccisi in questo modo, in quanto questi veleni venivano metabolizzati a livello gastrico; dunque soltanto l'iniezione diretta nel circolo ematico conservava l'effetto paralizzante). Invece bloccanti sui recettori neuronali sono anche chiamati bloccanti ganglio-plegici.


nAchR giunzioni neuro-muscolari (recettori muscolari); bloccati da basse concentrazioni di a-bungarotossina e bloccanti curarici

nAchR sinapsi gangliari, cellule cromaffini e SNC (recettori neuronali), bloccati da mecanilamina (ganglio-plegigi)



Il recettore più conosciuto tra quello neuronale e quello muscolare è indubbiamente quello muscolare. Quest'ultimo è formato da 5 subunità (è un pentamero): 2 subunità a1, una subunità b, g, d. L'Ach si lega a queste subunità a, e sono necessarie due molecole di Ach per attivare il recettore. Se noi aprissimo queste subunità potremmo notare come ognuna sia composta da 4 segmenti o domini (il recettore metabotropo è un recettore semplificato di una di queste subunità), chiamati M1,M2,M3,M4. Tutte le subunità hanno sia una parte extracellulare che intracellulare. Sul lato esterno si lega il trasmettitore. Nelle varie subunità, il segmento che guarda verso l'interno del canale sarà ovviamente ricco di cariche negative, per facilitare il passaggio di ioni carichi positivamente. La struttura dei recettori-canale è più o meno sempre questa: le subunità possono essere di diverso tipo ( a1 per il recettore nicotinico muscolare, a2 per il recettore nicotinico neuronale). Facendo una comparazione delle subunità dei vari recettori-canali, come il nicotinico-muscolare, poi quello neuronale, il GABA-A e la glicina, osserviamo che si somigliano abbastanza nella struttura per cui si ipotizza una comune origine. Sul versante opposto abbiamo invece i recettori degli aminoacidi eccitatori, gli NMDA e i non-NMDA (kainato-AMPA), che sono invece diversi: la parte extracellulare è più lunga. Le strutture più conservate sono quelle che hanno meno funzionalità: passano dentro alla membrana cellulare e servono solo ad ancorare il recettore. Sono invece differenziate le strutture alle quali è legata una funzionalità specifica.

La composizione delle varie subunità può variare, ed è questo che dà la selettività al recettore, che crea dunque dei sottotipi recettoriali.

Esistono, soprattutto per il recettore del GABA e del glutammato dei modulatori allosterici, cioè delle sostanze, per es. per il GABA le benzodiazepine, che sono dei farmaci molto usati come ansiolitici, che modulano allostericamente l'attività recettoriale. Le benzodiazepine agiscono aumentando il tempo di apertura del canale, e quindi aumentano l'iperpolarizzazione che è legata all'attivazione del recettore GABA-A.

Quindi questi recettori possono essere diversi a seconda della combinazione delle subunità e anche a seconda della presenza o meno di questi siti di modulazione allosterica.

I farmaci utili sul recettore nicotinico sono farmaci che bloccano il recettore. Ciò può essere fatto o con antagonisti competitivi come derivati del curaro ( la destro(d)-tubocurarina; è un antagonista competitivo perché si lega al sito dell'Ach e può essere rimosso aumentando le concentrazioni di Ach nello spazio intersinaptico, ad es. dando degli inibitori dell'acetilcolinesterasi; quindi se si vuole bloccare il rilasciamento muscolare si danno inibitori dell'acetilcolinesterasi; questi inibitori delle colinesterasi sono farmaci molto utili perché l'Ach è rapidamente metabolizzata, è un trasmettitore ad azione fugace). Altri farmaci che possono agire su questi recettori sono i curari depolarizzanti, che determinano una iniziale fascicolazione, come la succinilcolina e il decametonio; la succinilcolina è un farmaco molto simile all'Ach, ma ha il vantaggio di essere meno idrolizzata dalle colinesterasi, per cui attiva il recettore, ma come già detto, quando un recettore è attivato a concentrazioni elevate di un agonista va in desensibilizzazione (questo perché si attivano dei processi di difesa messi in moto dalla cellula: il recettore viene fosforilato e diviene non più attivabile; in questo caso l'aumento di Ach non rimuove il blocco, ma anzi lo prolunga).

L'attivazione continua, che può essere data da agonisti lentamente idrolizzati (es. succinilcolina) e da farmaci che bloccano la degradazione dell'Ach (acetilcolinesterasi), provoca la desensitizzazione del recettore.

Sul funzionamento del farmaco è importante valutare la via di introduzione e la biodisponibilità, cioè quanto composto rimane effettivamente attivo, dopo che è stato somministrato, la durata dell'azione farmacologica che è richiesta (quindi a seconda di quanto tempo noi abbiamo bisogno di questo rilassamento muscolare), la durata di permanenza nel compartimento ematico.







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