INTRODUZIONE AI CRITERI DIAGNOSTICI.

La stragrande maggioranza delle infezioni è asintomatica: tutti i giorni veniamo in contatto con agenti infettanti, non ce ne rendiamo neanche conto, il nostro sistema immunitario riconosce l'agente e risponde, 626f55g debellando l'infezione generalmente all'origine. Si possono rappresentare tutte le infezioni raggruppate come un iceberg, dove la parte sommersa e quindi più grossa rappresenta le infezioni asintomatiche, mentre la parte più piccola, che emerge, rappresenta le malattie sia meno severe che le gravi conclamate (che è poi quello che andiamo a diagnosticare in laboratorio).

Gli agenti infettanti come abbiamo detto prima derivano dall'ambiente, dagli animali e dall'uomo, che può essere portatore, sano o malato; l'individuo portatore in pratica ha un'infezione asintomatica e stanno clinicamente bene, ma senza sapere eliminano il microrganismo e lo trasmettono ad un altro individuo, quello sano invece trasmette dei microrganismi, che in condizioni normali magari non danno neanche infezioni, ad un immunodeficiente magari, creando gravi danni.

Gli agenti infettanti penetrano attraverso la cute lesa, anche una piccola puntura rappresenta un ingresso; oppure attraverso le mucose, in questo caso anche integre, come per es la congiuntiva, la mucosa respiratoria, quella digerente o quella genito-urinale per inalazione, o ingestione di alimenti e acqua contaminati, o per rapporto sessuale o col cateterismo vescicale; oppure per trasmissione verticale, cioè dalla madre al feto (in gravidanza, per passaggio di microrganismi attraverso la membrana placentare o tramite il flusso ematico o per via ascendente - ossia il microrganismo sale dalla mucosa vaginale alla placenta), che è pericolosissima, si rischia la morte del feto a seconda del momento dell'infezione, o dalla madre al neonato (attraverso il canale del parto o in allattamento).

Comunque o che si parli di infezioni esogene, o di infezioni endogene, i 3 punti cardine per

poter parlare di malattia infettiva conclamata sono: la carica infettante, la condizione di base fisiologica e l'efficienza immunitaria; così possiamo distinguere i patogeni "veri", ossia quelli che danno infezione in tutti gli individui, sani e non, perchè dotati proprio di una virulenza, dai patogeni opportunisti, ossia che provocano infezione solo in casi di immunodepressione.

Vi sono patogeni emergenti e riemergenti: alcune condizioni, di tipo comportamentale, sociale e anche terapeutico, hanno portato alla diffusione di nuovi microrganismi e/o alla diffusione di microrganismi un tempo debellati, o cmq presenti raramente nelle nostre zone; vediamo quindi le immunodeficienze da AIDS, trapianti e neoplasie che hanno portato all'emergenza di agenti e patologie un tempo sconosciuti, oppure i viaggi in zone diverse dalla nostra e soprattutto l'immigrazione che ha portato alla diffusione di agenti da tempo scomparsi, oppure l'uso stesso di antibiotici in modo eccessivo, un abuso che ha portato alla formazione nei microrganismi di ceppi resistenti (più che altro il problema nasce dagli animali: vengono dati loro dei mangimi mescolati ad antibiotici, intesi come "promotori della crescita", e in questo modo la flora degli animali si adatta a quegli antibiotici selezionando ceppi resistenti, che sono poi quelli che ci infettano e che non vengono eliminati proprio perchè l'antibiotico che prendiamo è diventato inefficace), infine gli stessi rapporti sessuali, specie quelli non protetti con più partner ha permesso la diffusione di molte malattie veneree.  Un germe che sta diventando molto pericoloso è l'Enterococco, che sta diventando resistente all'antibiotico Vancomicina, che era l'unico che riusciva a contrastarlo.

Principi di diagnosi: è di due tipi, DIRETTA se andiamo a ricercare il microrganismo, o gli Ag oppure i suoi prodotti quali tossine oppure andando a ricercare l'acido nucleico, INDIRETTA SIEROLOGICA se invece andiamo a ricercare una risposta anticorpale (quindi Ac) nei confronti di quel patogeno (viene fatta se non è possibile isolare il patogeno in coltura, come ad es. il Treponema pallidum, agente eziologico della sifilide).

I distretti sterili del nostro organismo, cioè che non hanno una colonizzazione microbica normale, sono tutti i distretti chiusi, cioè che non comunicano con l'esterno, quali il sangue, il LCR, il liquido pleurico, il liquido peritoneale, il BAL e le vie respiratorie profonde, l'urina (però in realtà per urina ci si riferisce a quella nella vescica, a quella che in pratica non è ancora passata per le mucose genitali, in quanto queste sono ricche di flora normale e pertanto, al momento del passaggio dell'urina, la contaminano; è quindi molto importante da tener conto, perchè se in laboratorio seminiamo urina e si formano colonie, è importante distinguere quelle normali della mucosa genitale da quelle che effettivamente stanno dando un'infezione. Stesso discorso per BAL, in quanto viene fatto con sonde che sono inevitabilmente contaminate). I distretti invece colonizzati sono la cute, l'intestino, i genitali soprattutto vagina, il cavo orale e le altre vie respiratorie. I materiali quindi che arrivano al laboratorio sono squame, feci, essudati, saliva (tutti quindi in coltura danno colonie normali, quindi bisogna distinguere bene le normali dalle patogene) urina, liquidi e sangue (che invece devono esser sempre privi di microrganismi - ricorda però la nota dell'urina).

I microrganismi infettano diversi distretti, hanno talvolta un tropismo per un determinato distretto, ma è importante considerare l'intestino, munito di tanti e diversi microrganismi, soprattutto anaerobi, a seconda del tratto intestinale e con una carica batterica elevatissima; nello stomaco invece per es non dobbiamo trovare dei microrganismi (ad eccezione dei Lactobacilli che sono debolmente acidi), in quanto è presente un'acidità che non ne permette la sopravvivenza; nella bocca ci sono diversi Streptococchi, Neisserie e Stafilo-

cocchi; sulla cute abbiamo di tutto... insomma normalmente convivono con noi proteggendoci dalle invasioni esterne e aiutando in modo commensale il nostro organismo senza provocarci alcun danno, diventano pericolosi e danno infezioni endogene solo, come detto, in determinate situazioni solo.

I patogeni veri, esogeni invece, sono quelli che cerchiamo effettivamente in laboratorio, in modo da diagnosticare infezione e dare terapia. Se in una coltura ricca di colonie normali troviamo una colonia di salmonella, abbiamo fatto diagnosi di salmonellosi, quel batterio non ci deve essere normalmente, quindi è importante non solo conoscere quali sono i patogeni veri, ma anche quelli della flora normale, in modo da fare una diagnosi giusta. Nello stomaco un patogeno è l'H. pylori; nell'intestino come patogeni ci sono soprattutto salmonella, shigella, yersinia, campylobacter, i coli patogeni, E.histolitica; nelle vie aeree non ci devono esser micobatteri, N.meningitidis, la difterite, M.pneumonie, clamidie, funghi e diversi stafilococchi; nelle aree genitali sono patogeni N.gonorrea, T.vaginalis, il Treponema o i micoplasmi.

Importanza del campione biologico: è importante fare un prelievo prima di una terapia antibiotica se possibile, valutare bene il momento del prelievo, valutare esattamente la sede di infezione, raccogliere materiale sufficiente per fare tutti gli esami richiesti.

Le modalità di raccolta del prelievo devono esser fatte con criterio, i materiali sterili non devono esser contaminati e quindi vanno portati in contenitori sterili in totale asepsi, uso di terreni di trasporto in gel per i tamponi in modo da non far seccare il microrganismo, l'uso di fissativi per gli esami parassitologici. I materiali vanno inviati al laboratorio nel minor tempo possibile e poi conservati secondo le modalità del laboratorio: alcuni vanno processati subito, altri vanno conservati per 24-48 ore.

Abbiamo come contenitori quelli a tappo a vite, i tamponi con terreno di trasporto, i contenitori col cucchiaino per le feci e la coprocoltura, i tamponi diversi per il meato uretrale o dell'occhio, il set per l'emocoltura: il sangue va prelevato con una cannula con doppio ago, uno nel braccio e l'altro nel flacone dell'emocoltura, in modo da evitare il rischio di contaminazione, se c'è una contaminazione del sangue è da attribuire (se non c'è infezione ovviamente) a una cattiva manovra al momento del prelievo, come ad es una cattiva disinfezione della cute prima del prelievo.

Innanzi tutto è importante la valutazione del paziente: a seconda dei sintomi del paziente e della localizzazione dell'infezione vanno prelevati i campioni giusti, nella sede giusta, in rapporto a quella che è la patologia che presenta.

Nei moduli di richiesta d'esame è importante ricordare che bisogna segnare le indicazioni richieste nella prima parte dei moduli, come per es se il paziente sta facendo una cura antibiotica o se ha una qualche patologia di base, se è in gravidanza, se ha già un'infezione precedentemente diagnosticata, il tutto ai fini di ottimizzare la diagnosi o cmq di fare una diagnosi giusta: se troviamo uno stafilococco normale della cute e non troviamo nessuna indicazione riguardo il paziente, non ci preoccupiamo minimamente e diamo un referto negativo, ma se il paziente è per es un immunodepresso o un neonato ed è segnato sul modulo ecco allora che ne teniamo in considerazione ai fini di una buona diagnosi. Ecco allora l'importanza dell'accettazione, che controlla le schede, le non conformità, gli orari di arrivo dei prelievi (ci sono esami, specie sul sangue, che devono esser fatti entro un determinato tot di tempo, pena non si riesce più a lavorare sul campione), poi lo smistamento dei campioni nei vari settori e processazione dei campioni in modo diverso a seconda del materiale e a seconda del tipo di agente patogeno da ricercare: alcuni esami vengono fatti di routine (es urinocultura), altre invece su richiesta (per es ricerca dei micobatteri). Il laboratorio quindi procede con tutte le indagini microscopiche, culturali e sierologiche, citogenetiche, antibiogramma...

Gli esami microbiologici hanno tempi lunghi di risposta in rapporto alle caratteristiche biologiche degli agenti infettanti, anche se alcuni test danno risp piuttosto rapide, e uno degli obiettivi attuali è proprio quello di utilizzare delle metodiche che possano accelerare i tempi di risp e fornire ai clinici delle informazioni in tempi più rapidi, perchè a volte aspettare delle settimane per alcuni esiti, come ad es per i micobatteri, voleva dire dare delle risp anche dopo mesi, avendo poi ovviamente problemi! Quindi diciamo che normalmente si utilizzano gli esami tradizionali culturali che danno una risp dopo 2-3gg, però in alcuni casi conviene fare test molto rapidi. Un test rapido è quello immunologico che si fa in poche ore o minuti, specie sul liquor che viene bollito per la ricerca degli Ag capsulati dei batteri che danno la meningite, onde evitar di aspettar 24-48 ore la coltura per poi fare identificazione e antibiogramma; altro test rapido è l'esame stesso a fresco al microscopio, si vedono subito i micobatteri o gli elminti. I test tradizionali sono quindi 24-48 ore come minimo più eventuali ripetute, identificazione e antibiogramma. In alcuni casi bisogna dare indicazioni diagnostiche per i patogeni "veri", cioè se si vede un agente che non ci dovrebbe essere significa già aver fatto una diagnosi di malattia infettiva ancor prima che il clinico aspetti il referto, cioè vedere una per es. una N. gonorreae significa già esser di fronte ad un agente che normalmente non ci deve esser e quindi possiamo già dire che il paziente ha un'infezione da gonorrea senza passare dal clinico. Un modo per aiutarci a fare questa diagnosi è utilizzando le colorazioni, tipo Gram, Ziehl Neelsen, Truant in fluorescenza, oppure facendo direttamente esame a fresco.

È cmq sempre importante fare un esame colturale, ossia isolare i microrganismi su terreni selettivi, cromogeni, universali, terreni specifici per evidenziare un'attività emolitica... ce ne sono di tutti i tipi. Segue l'identificazione biochimica, il rilevamento della carica microbica, l'antibiogramma e, in alcuni casi, la tipizzazione sierologica (specie per salmonelle, streptococchi, neisserie...) e la genotipizzazione. Uno volendo potrebbe usare la PCR, vedrebbe già l'acido nucleico, sarebbe facile, il problema però viene poi per l'antibiogramma, che si può fare solo se abbiamo una colonia in coltura, oppure sarebbe impossibile conservare i ceppi nuovi e quindi sarebbe impossibile studiarli per sperimentare nuovi farmaci o tenerli "sotto mano" nel caso si verifichi un'epidemia da quel ceppo, ecco perchè quindi l'esame colturare resta il migliore.

L'identificazione quindi è fatta col Vaitec e in pratica riconosce il batterio in base al suo profilo biochimico, lo identifica mediante caratteristiche biochimiche specifiche quali produzione di zuccheri o produzione e utilizzo di sostanze, che comporta un cambiamento di pH e quindi ci dice che la reazione è positiva identificando il batterio. Dopodichè fa l'antibiogramma con il metodo della diluizione, che come sensibilità del ceppo isolato ha degli antibiotici in fondo a pozzetti di diluizione, a diversa concentrazione, e la concentrazione più bassa di antibiotico che inibisce la crescita batterica si definisce MIC ed è quella che sarà somministrata nella terapia al paziente. Fino a poco tempo fa invece l'antibiogramma era fatto con un altro metodo, manuale, su piastra, per diffusione dell'antibiotico sulla piastra che andava a creare un dischetto di inibizione intorno al germe specifico. È comunque compito del clinico interpretare secondo diversi criteri il chemioantibiotico da dare.

Altri aspetti da considerare sono la ricerca di componenti substrutturali, quali proteine, polisaccaridi e acidi nucleici, quando ci sono degli agenti particolari, che non si coltivano facilmente, che non si vedono con i metodi tradizionali, quando non sono più vitali (nei pazienti in terapia intensiva i germi perdono la loro vitalità, allora il rischio sarebbe di dare falsi negativi, invece ricercando le sue parti possiamo dare un positivo se c'è); di solito queste ricerche vengono fatte in virologia, ma anche per i batter sul LCR, per la clamidia nelle mucose genitali, per i micobatteri, il tutto con il vantaggio di dare risposte mirate e in tempi rapidi, ma con lo svantaggio di non avere nè un isolamento per ulteriori indagini, nè un antibiogramma.

Oppure la ricerca degli antigeni della legionella o dello pneumoniae su urina per la diagnosi di polmoniti mediante metodi immunoenzimatici, antigeni capsulari dei batteri che provocano meningite su liquor mediante test di agglutinazione in lattice.

La diagnosi indiretta sierologica non vuol dire che se troviamo degli Ac per un agente allora siamo appena stati infettati, perchè è normale che in condizioni di salute ottime presentiamo Ac per degli agenti patogeni che però abbiamo magari incontrato o in forma asintomatica, o in un periodo precedente della nostra vita. Dobbiamo quindi valutare degli aspetti, diagnosticando un'infezione esaminando almeno 2 prelievi di sangue a distanza di 7 gg l'uno dall'altro e osservando se è presente un movimento anticorpale, e se vediamo che il titolo del secondo siero è 3-4 volte più alto rispetto al primo siamo di fronte a sieroconversione, cioè di fronte ad infezione in atto; altro aspetto è la ricerca di IgM, prodotte all'inizio dell'infezione, indice della fase acuta della malattia e indice anche di un'infezione uterina, in quanto la presenza di IgM in un neonato è indice che il neonato ha contratto un'infezione durante la gravidanza (le IgM non passano la barriera placentare al contrario delle IgG, per cui se ci sono, significa che le ha prodotte il bambino, morale si è infettato).

Le principali reazioni sierologiche sono l'agglutinazione, l'ELISA, l'IFA, l'immunodiffusione e la Western Blot. L'agglutinazione indiretta è una reazione che interviene tra un Ag corpuscolato e il siero del paziente che contiene Ac (viceversa se è diretta); si forma così l'immunocomplesso che è visibile ad occhio nudo in quanto il corpuscolo che abbiamo è legato o a lattice, o a eritrociti (il TPHA conferma della sifilide) o al carbone (per il Treponema della sifilide). Nell'ELISA (la classica automazione dei laboratori) l'anticorpo è marcato con enzima: si forma immunocomplesso che viene evidenziato da un anti-Ac marcato con enzima, dopodiche si aggiunge il substrato e se c'è reazione il substrato appare colorato. Nell' IFA l'immunocomplesso è messo a contatto con l'anti-Ac marcato con fluoresceina, e se c'è reazione vedremo al microscopio la fluorescenza. L'immunodiffusione è fatta per gli Ac funginei, su piastra di agar, si mette una goccia di Ag e una di Ac specifico sulla piastra, si lascia ad incubare e diffondere a T ambiente per 48 ore, e se si crea l'immunocomplesso si forma una banda di precipitazione.