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I LIEVITI - PARETE - MEMBRANA

microbiologia


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I LIEVITI

Sono funghi unicellulari perciò in condizioni avverse producono aschi all'interno delle quali vi sono le spore.

I lieviti vinari si suddividono in:

- Ascomiceti

- Deuteromiceti (funghi imperfetti che si riproducono per via asessuata)

Sono cellule eucariote composte da:

PARETE 

-         protezione



-         dà forma e rigidità

-         struttura elastica per facilitare l'assorbimento delle sostanze. È porosa cioè permeabile ai soluti.

-         di natura polisaccaridica

-         componenti fondamentali :

                         glucani,mannoproteine 

           (mannosoio + proteine)   70%

           chitina (1-2%),

enzimi    30%

                                                     

Nei lieviti vinari la chitina è localizzata nelle cicatrici della cellula dopo la riproduzione asessuata.

I lipidi non sono tipicamente appartenenti alla parete ma provengono dalla membrana o dal mezzo.

La parete non interviene direttamente tra cellula e ambiente.

SPAZIO PERIPLASMATICO nella quale si trovano molti enzimi.

MEMBRANA

-         consente attivamente o passivamente lo scambio

     doppio strato fosfolipoproteico, i lipidi più presenti sono gli steroli e il più

     importante è l'ergosterolo. È una sostanza sintetizzata in aerobiosi. Le microareazioni fatte durante la F.A servono dunque oltre alla moltiplicazione dei lieviti, alla produzione di ergosterolo (sostanza di sopravvivenza).

In mancanza di ergosterolo, non si fermenta più lo zucchero quindi per favorire il lievito nella c 424f51e onclusione della F.A, si aggiungono nel vino gli steroli.

La % di steroli  nella membrana aumenta l'alcol tolleranza quindi sarà maggiore la possibilità di portare a secco il vino.

- selettiva, permeabile ai liquidi, semi-permeabile ai soluti

La membrana è molto ricca di enzimi.

Permeasi: aiutano e favoriscono l'entrata e l'uscita delle sostanze.

 

PLASMIDI

Sono molto importanti per poter trasferire da un ceppo di lieviti ad un altro caratteristiche enologiche; si fa anche da batterio a lievito. Molto importante dal punto di vista del miglioramento enologico.

VACUOLO

Nel caso dei lieviti è un magazzino anche di idrolisi, ci sono inoltre enzimi detti proteasi che distruggono l'impalcatura proteica della cellula (autolisi), in seguito rimane soltanto la parete.

L'energia per l'autolisi è ricavata dagli zuccheri di riserva(glicogeno) respirati intensamente. Avviene quando il lievito si trova in condizioni sfavorevoli per la sopravvivenza.

Nel citoplasma ci sono tutti gli enzimi per la glicolisi della fermentazione alcolica.

CITOSOL soluzione che contiene enzimi solubili, glicogeno e ribosomi

APPARATO DEL GOLGI immagazzinamento e trasformazione delle proteine da trasferire poi al vacuolo.

MITOCONDRI

Alla periferia del citoplasma. Organuli respiratori. In anaerobiosi questi organuli spariscono.

NUCLEO

Forme di riproduzione

 

In condizioni favorevoli

Temperatura                                   riproduzione asessuata, cioè per gemmazione

pH                                                  e raramente  per scissione

disponibilità di nutrienti

In condizioni sfavorevoli

il fungo sporifica, quindi si ha la formazione dell'asco preceduta da una coniugazione oppure è la stessa cellula di lievito che diventa asco.

Nel vino non si vengono a creare situazioni non favorevoli ed inoltre la sporificazione avviene solo in presenza di ossigeno quindi non si verifica.

Nel vino però si può verificare l'autolisi. In questo caso il lievito utilizza tutte le sue sostanze di riserva( glicogeno) che vengono scisse in monosaccaridi e respirate intensamente per ricavare energia per l'abbattimento delle strutture della cellula tranne della parete. Ciò avviene a 45-50°C e pH 4-4,5.

I batteri lattici si nutrono del pull aminoacidico delle cellule di lievito autolisato perciò le scorze di lievito vengono polverizzate dall'industria e aggiunte ad inizio fermentazione come nutrienti.

Lievito varietale: esalta l'aroma del vigneto. Utilizzando i lieviti autoctoni mantengo il binomio lievito-vitigno.

Per clonare i lieviti autoctoni:

v      filtrazione del mosto a fine F.A

v      si coltiva in piastra

v      si fa essiccare dall'industria

L'identificazione dei generi:

-         modalità di moltiplicazione

-         la forma delle spore

-         numero di spore per asco

-         le modalità di sporificazione

-         la capacità o l'incapacità di fermentare gli zuccheri

-         la capacità di sviluppo alla superficie con formazione di pellicole

Comportamento nei confronti di fonti nutrizionali

N - la forma più prontamente assimilabile è quella ammoniacale subito dopo quella organica sotto forma amminoacidica o tutt'al più peptidica, non vengono assunte le forme gassose. Alcuni amminoacidi vengono assunti con diverse gradazioni di assimilazione addirittura sembra non vengano assunti alcuni amminoacidi come la prolina; è meno gradita l'assunzione di amminoacidi dato che il loro metabolismo implica la formazione di alcol superiori che già naturalmente si formano e in dosi eccessive vanno ad alterare la qualità del vino, i lieviti infatti producono autonomamente amminoacidi e quelli in eccesso vengono deaminati, decarbossilati e ridotti con formazione di alcol secondari. Quando si prepara lo starter nei lieviti in moltiplicazione si aggiungono Sali (fosfati o sofati) di ammonio detti attivanti; i solfati possono essere carenti nei mosti , sono molto importanti per la produzione di amminoacidi solforati. Gli amminoacidi possono essere utilizzati sia per via anabolica che catabolica. I mosti non possono essere significativamente carenti in N.

Zuccheri - Fonte energetica. Possono utilizzarli:

-         respirandoli; se si trovano in un mezzo areato. Ai soli fini moltiplicativi. Energia prodotta 38ATP

-         fermentandoli; in assenza di ossigeno. Glicolisi-ac.piruvico-acetaldeide-alcol etilico energia generata 2ATP si genera poca energia perché il composto ottenuto è ad alto contenuto calorico.

Assimilano la forma monosaccaridica, glucosio e fruttosio.

Il melibiosio e il saccarosio sono utilizzati solo se il lievito possiede l'enzima per idrolizzarli. Non utilizzano i pentosi.

 la forma assimilata è quella monosaccaridica i pentosi non vengono assunti dai lieviti, le fonti carboniose sono le fonti energetiche che vengono utilizzate attraverso la respirazione in presenza di ossigeno o attraverso la fermentazione di caso di anaerobiosi, caso in cui si ha la FA il cui scopo principale è la fermentazione degli zuccheri esosi e la loro trasformazione in alcol e prodotti secondari con il giusto equilibrio; durante questa fase si formano solo due ATP. La sola fase di respirazione in campo enologico avviene durante la preparazione dello starter in cui i lieviti si devono riprodurre; ma durante la FA vengono praticate micro aerazioni per permettere ai lieviti di riprodursi sintetizzare steroli e produrre energia in modo da portare i vini a secco e la FA a termine senza arresti.

Vitamine (fattori di crescita) - i lieviti necessitano di vitamine tipo: riboflavina, tiamina, in particolare acido pantotenico ecc, alcune vengono sintetizzate altre sono necessarie nel mezzo, negli starter può essee aggiunta tiamina come attivante di moltiplicazione

Sali minerali - importanti K, P, S, Ca, Mg

Comportamento nei confronti dell'ossigeno - se è presente i lieviti lo utilizzano per respirare gli zuccheri, ricavando energia per la moltiplicazione con un notevole aumento della massa a scapito dell'alcol; con questo principio si prepara lo starter per l'inoculo che avviene al momento della piena attività moltiplicativa per far sì che siano in grado di prendere in possesso il mezzo sopraffacendo la flora microbica indigena. Il numero di cellule all'inoculo deve essere di 106 cellule/ml circa dopo l'inoculo si sottrae l'ossigeno e lo si ripropone sotto forma di micro aerazioni per favorire la sopravvivenza dei lieviti e per la loro moltiplicazione; con la sintesi di steroli aumenta l'alcol tolleranza e quindi il ritardo dell'inibizione e la morte del lievito, si possono aggiungere steroli alla fine della FA per riuscire a portare a secco il vino in esame.



I lieviti della fioretta respirano l'alcol formando una patina sulla superficie del vino.

Comportamento generale durante la fermentazione alcolica - possiamo dividere il periodo della fermentazione alcolica in 5 fasi

I.  fase di adattamento in cui alcune cellule muoiono e i lieviti non si riproducono a causa dell'adattamento al mezzo

II. fase di crescita esponenziale i lieviti si sono adattati al mezzo e si moltiplicano esponenzialmente

III.                      fase stazionaria quella che l'enologo cerca di mantenere il più a lungo possibile in quanto è il momento in cui la maggior parte degli zuccheri viene fermentata e l'alcol prodotto

IV. fase di declino momento in cui le cellule cominciano a morire e non vengono sostituita da nuove cellule

V. fase di cellule quiescenti o morte totale tutte le cellule sono morte o alcune sono sopravvissute sotto forma di spore

la fermentazione alcolica produce in equilibrio etanolo e prodotti secondari derivanti dal metabolismo di zuccheri ed altri elementi.

I principali prodotti secondari sono: glicerolo, acido acetico e alcol superiori(sono normalmente prodotti dal metabolismo dell'N o da quello degli amminoacidi.

La malo alcolica viene effettuata dallo schizzo saccaromices pombe che però non interviene nel caso in cui il mosto sia solfitato; il cerevisiae non è in grado di praticarla e non è ricercata perché diminuisce l'acido malico dei vini rendendo difficile la malolattica o abbassando troppo l'acidità del vino, inoltre con questo meccanismo si alza di molto l'acidità volatile

Fattori che influenzano la fermentazione alcolica - i fattori che influenzano la FA sono essenzialmente:

*   temperatura

*   pH

*   residui di fitofarmaci

*   concentrazione degli zuccheri

Lievito

forma

Caratteristiche enologiche positive

Caratteristiche enologiche negative

Famiglia  Saccharomycetaceae

Saccharomyces cerevisiae

Globose,ellittiche o cilindriche. Possono essere molto lunghe per via della formazione di ife.

Singole o

appaiate.

Alto livello di:

-alcol tolleranza

-vigore  fermentativo

-resistenza agli antisettici

-temperatura di vinificazione

      _________

Pichia membranaefaciens

ovali o allungate

possono essere presenti delle pseudoife

    __________

Attacca l'alcol, sviluppa bene in superficie dove forma pellicole secche e lisce o fiocchetti(fioretta).

Priva di attività fermentativa

Torulaspora delbrueckii

globose o ellittiche con possibile presenza di pseudoife

Lievito buono utilizzato soprattutto per le fermentazioni scalari ( come primo inoculo e dopo di questo il S. cerivisiae.

Forte vigore fermentativo.

Buona resistenza agli antisettici.

Potere alcoligeno limitato, a 9-10% vol non riesce a lavorare.

Hansenula anomala

Sferica, ellittica o allungata

   ___________

Attacca l'alcol, sviluppa bene in superficie dove forma pellicole secche e lisce o fiocchetti(fioretta).

Zygosaccharomyces bailii

Globose, ellittiche e cilindriche

Lievito osmofilo (resiste ad alte concentrazioni di zucchero)

Buona attività fermentativa.

Adottati anche per fermentazioni scalari.

Famiglia

Saccharomycoidaceae

Hanseniaspora guilliermondii

Cellule globose, ellittiche o cilindriche

Forma sessuata del Kloeckera apis




Hanseniaspora

uvarum

Cellule globose, ellittiche o cilindriche

Forma sessuata del Kloeckera apiculate

 

Saccharomycodes ludwigii

Voluminose, apiculate ed estremità arrotondate oppure ovali o allungate con un rigonfiamento centrale(a suola di scarpa).

Quando è in gemmazione ha la forma di un birillo in quanto la cellula figlia si trova ad un polo della cellula.

Forte resistenza alla solforosa.

Riesce a far fermentare anche mosti muti.

   ____________

Famiglia

Schizosaccharomycetaceae

Schizosaccaromyces pombe

globose, ellittiche o cilindriche con bordi arrotondati.

A seconda dello stadio di sviluppo si può  presentare sottoforma di filamento sembrando un ifa.

Per mosti troppo acidi, abbatte l'ac.malico trasformandolo in alcol.

Ottima attività fermentativa.

i prodotti secondari che genera non sono buoni ed incrementano l'acidità volatile perciò non è indicato se non un tipo specifico. Non è gradito l'intervento del pombe durante la F.A visto che abbatte l'acidità.

Famiglia

Candidaceae

Candida  vini

Globose, ovoidale, cilindrica o allungata, raramente apiculate, ogivale o triangolare.

   __________

Privo di attività fermentativa.

Sviluppa sulla superficie dove è l'agente principale della fioretta formando quindi veli voluminosi e fragili

Candida pulcherrima

Cellule molto grandi e sferiche che contengono una bella goccia lipidica

   __________

    ___________

Kloeckera apiculata

Apiculate (per la forma a limone quando sono in gemmazione), od ovali o allungate.

Forma imperfetta (asessuata)

Più frequente nei mosti e sono responsabili dell' avvio della fermentazione spontanea.

Elevato vigore fermentativo.

Produce un elevata quantità di ac.acetico, non hanno un buon potere alcoligeno(4-5%vol) quindi non può portare a termine la F.A

Sensibili alla solforosa

Kloeckera apis

Apiculate (per la forma a limone quando sono in gemmazione), od ovali o allungate.

Forma imperfetta (asessuata)

Brettanomyces

Globose spesso ogivali

    __________

Producono elevate quantità di acido acetico quindi aumento di acidità volatile.

Alterazioni dei vini.

 

La fermentazione spontanea dei mosti

Il mosto d'uva come mezzo nutritivo

Il mosto ha una composizione soddisfacente dal punto di vista nutrizionale in quanto presenta zuccheri, composti ammoniacali e amminoacidi, fosfati, solfati e vitamine anche se alcune volt possono verificarsi squilibri nutrizionali per quanto riguarda le fonti azotate.



Il fattore che veramente limita lo sviluppo dei microrganismi nel mosto è rappresentato dal pH, i cui valori sono fra  e 3 e 3.5; i microrganismi che tollerano tali sogli di pH sono:

*     lieviti che hanno valori di pH intorno a 4-4.5 ma si sviluppano anche a pH 3

*     batteri acetici

*     alcuni batteri lattici quali oenococcus oeni e alcune specie del genere lactobacillus

*     muffe che sono poco influenzate da valori di pH di un ampio raggio

Microflora epifitica prende questo nome l'insieme dei lieviti già presenti sui grappoli che iniziano la loro attività poco dopo (in genere un giorno) il riempimento delle vasche dando inizio alla fermentazione alcolica.

È noto da molto tempo che la fermentazione viene avviata da lieviti apiculati e solo in seguito compaiono lieviti di forma cilindrica; effettuando prelievi e colture in successione possiamo avere una panoramica completa della popolazione microbica presente prima, durante e dopo la fermentazione.

Le popolazioni di lieviti che giocano un ruolo fondamentale nella fermentazione alcolica sono essenzialmente 2 :

*     Kloeckera apiculata , tipico rappresentante degli apiculati è dominante nelle prime fasi della fermentazione, ottimo vigore fermentativo viene però messo in difficoltà dall'alcol a causa del basso potere alcoligeno a livello di 4 gradi alcol si arrestano

*     Saccaromyces cerevisiae, rappresentante degli ellittici, entra in azione prendendo il sopravvento non appena cessano i Kloeckera ottimo vigore fermentativo ed elevata alcoltolleranza, questo lievito è molto meno diffuso degli apiculati ma grazie al suo potere alcoligeno, il più elevato, che raramente scende sotto i 10gradi alcol ed arriva a toccare i 20 prende il sopravvento sugli apiculati indeboliti dal grado alcolico del mezzo

Oltre a questi due lieviti sono da ricordare per i loro interventi nella fermentazione:

*     Torulaspora delbruchei

*     Zygosaccaromices bailii

*     Schizzosaccaromyces pombe

Altri lieviti marginali sono:

*     Saccaromicodes ludwigi

*     Brettanomices

Al termine della fermentazione se non viene impedito il contatto con l'aria è inevitabile lo sviluppo dei lieviti della fioretta:

*     Picchia membranafaciens

*     Candida vini

*     Hansenula anomala

Gli studi hanno dimostrato che il Saccaromyces cerevisiae ha un ruolo prevalente nella fermentazione spontanea dei mosti anche se la sua predominanza dipende esclusivamente dalle condizioni che lo favoriscono in primo luogo la concentrazione alcolica; propiro per la suo scarsa presenza in natura si formulò l'ipotesi che il saccaromyces cerevisiae si perpetuasse nelle cantine, portata all'esasperazione dalla credenza che questo fosse un lievito domestico e non esistesse in natura; la teoria venne smontata dal fatto che accurata igene di cantina con lavaggi e pulizia non potevano permettere lo sviluppo e la sopravvivenza di anno in anno di lieviti in nicchie di  cantina.

Il marciume acido è una malattia che colpisce il grappolo ed ha importanti conseguenze per le popolazioni di lieviti dell'uva.si manifesta quasi esclusivamente in fase di maturazione ed ha un andamento esplosivo praticamente indipendente dall'andamento meteorologico; è riconoscibile per la graduale degradazione della buccia e dal caratteristico odore di acido acetico.

Le fermentazioni spontanee nella vinificazione tradizionale

Nel passato nelle fermentazioni spontanee alla fine della fermentazione tumultuosa ad opera degli apiculati si potevano verificare diverse situazioni:

*     Presenza di ceppi ecologicamente buoni e vino portato a secco

*     Residui zuccherini a causa dell'assenza di ceppi buoni o condizioni di temperatura sfavorevoli a questi (caso più frequente)

*     Risultati sconcertanti dovuti a pombe o brettanomices che prendono il sopravvento

Al termine dell'inverno all'imbottigliamento poteva accadere che:

*     Vino portato a secco non suscettibile a fermentazioni, vino tranquillo

*     Vino contenente residui zuccherini in minime quantità con ceppi di cerevisiae con produzione di vino bianco secco

*     Produzione di vino più o meno dolce a causa degli zuccheri rimasti ma comunque tranquillo

*     Vino con elevate quantità di zucchero e ceppi dotati di basso potere fermentativo con produzione di vino dolce frizzante

*     Vino con elevati residui zuccheri e ceppi di cerevisiae con aumento della pressione dovuto alla fermentazione e salto del tappo o scoppio della bottiglia

Attualmente il controllo della temperatura e l'utilizzo di solforosa hanno reso più controllabile e standard la vinificazione.

Intervento sulla fermentazione dei mosti

Per le fermentazioni scalari si possono utilizzare colture selezionate, si realizza utilizzando due ceppi diversi di lieviti il secondo dei quali è il Saccaromyces cerevisiae inoculato dopo alcuni giorni (4-5) dal primo inoculo con ad esempio Zygosaccaromyces veronae la fermentazione è più lenta e regolare con minimi valori di acidità volatile.

Sono stati ottenuti ottimi risultati anche con l'accoppiamento torulaspora delbrueckii e saccaromices cerevisiae la fermentazione scalare però non ha trovato grande applicazione questo principio però è molto importante in quanto lieviti non saccaromyces possono apportare migliori qualità al vino.

Il metodo super 4 prevede la fermentazione di mosti con livello di alcol superiore a quattro in modo da utilizzarlo come inibente ed omettere la solfitazione, utilizzato nella vinificazione continua diventa problematico per quella discontinua.

L'anidride solforosa ha molte funzioni:

*     Impedisce lìossidazione ad opera degli enzimi ossidasici della botritis

*     Con bassi valori di pH agisce come antisetti

*     Inibisce completamente gli apiculati

Saccaromycodes ludwigi resista alla solforosa al punto da fermentare mosti muti

I lieviti autoctoni

Contestazioni del metodo:

*     Poche colture reperibili in commercio che per le loro caratteristiche generiche rischiano di rendere uguali tutti i vini

*     Non è possibile che tutti i lieviti siano ugualmente adatti alla fermentazione di tutti i mosti

*     Un lievito isolato in una determinata zona viticola può non essere adatto per zone pedologiche diverse

La richiesta da parte dei consumatori di qualità sempre migliori e caratteristiche diverse per i vari vini e vitigni ha portato le aziende più grandi a specializzarsi nell'isolamento dei lieviti autoctoni che si originano con mutazioni e intrecci con altri habitat ogni anno.

Il genius lociè quell'insieme di di fattori legati all'ambiente alle pratiche colturali e alla cantina che nel loro complesso danno al vino caratteristiche esclusive e si mantengono costanti nel tempo; per determinare il genius loci i lieviti autoctoni svolgono un ruolo molto importante.







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