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PROCEDURA DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI BIOLOGICI PER L'OSSERVAZIONE AL TEM

biologia


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PROCEDURA DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI

BIOLOGICI PER L'OSSERVAZIONE AL TEM

1.1 Fissazione

E' un procedimento fisico o chimico che deve essere effettuato subito dopo il prelievo del tessuto e serve per bl 525i87f occare la decomposizione delle cellule e dei batteri (procarioti).



La fissazione fisica avviene mediante le alte temperature o tramite congelamento (criofissazione); questo metodo, però, può portare alla variazione di alcune strutture ed è utilizzato soprattutto per studi enzimatici ed immunocitochimici.

La fissazione chimica è quella più usata: viene effettuata mediante sostanze che si legano alle molecole proteiche del campione e le stabilizzano.

Un tipo di fissazione standard avviene con l'impiego di glutaraldeide al 2,5% in Tyrode 0,1 M a pH7,3; Blu di Toluidina, detto BTo, allo 0,1% e successivamente con tetrossido d'osmio (OsO4).

Ognuno di questi composti ha una funzione ben precisa: la glutaraldeide reagisce con le proteine mentre il BTo ha una funzione colorante (blu-violaceo), e mette in evidenza prevalentemente i proteoglicani. Il Tyrode è invece un tampone salino, ovvero una soluzione con funzione di stabilizzare il pH su un certo valore: 7,2-7,4. L'OsO4, infine, è anch'esso un fissativo ma agisce soltanto con certi lipidi: quelli saturi non reagiscono mentre i grassi insaturi riducono la sua molecola; si formano così dei composti neri contenenti l'osmio o il suo idrossido. Criegee (1936) suggerì che ciò è dovuto all'ossidazione dei doppi legami tra atomi di carbonio adiacenti.

Le concentrazioni e i tempi di applicazione dei fissativi cambiano a seconda dei tessuti e degli scopi che si vogliono ottenere. E' importante però che le soluzioni utilizzate abbiano un pH compatibile con quello dei campioni e che le concentrazioni siano tali da non produrre fenomeni osmotici, per i quali le cellule si gonfierebbero o si raggrinzirebbero alterando la loro struttura. Per misurare il pH delle soluzioni si ricorre all'uso del piaccametro: questo strumento deve essere tarato utilizzando tamponi di acidità predeterminata prima di eseguire le misurazioni. Successivamente si provvede a correggere il pH delle soluzioni, mediante aggiunte di HCl o NaOH a diverse concentrazioni, a seconda che la soluzione sia rispettivamente troppo basica o troppo acida.

1.2 Disidratazione

Consiste nel togliere tutta l'acqua presente nei campioni e sostituirla con alcool.

Questa operazione è indispensabile per poter osservare i tessuti al microscopio elettronico e avviene mediante immersioni in soluzioni alcoliche a concentrazioni crescenti: si parte da con una concentrazione di etanolo pari al 30%, per finire, dopo passaggi intermedi (50%, 70%, 90%), con quella al 100%.

A questo tipo di disidratazione segue quella con ossido di propilene (OP) che ha il vantaggio di miscelarsi perfettamente con la resina (cosa che l'alcool non fa) che verrà utilizzata successivamente per l'inclusione.

Ogni passaggio ha una durata che varia tra i 5 e i 10 minuti e il tempo complessivo varia a seconda dello spessore dei campioni.

1.3 Inclusione

Una volta che il campione è stato fissato e disidratato deve essere incluso in resina per poterlo conservare e tagliare.

L'inclusione può essere fatta con vari tipi di resina a seconda degli usi: se questa è costituita da un insieme di paraffine, ad esempio, il campione non potrà essere tagliato in sezioni più sottili di 5 micron, sufficienti per la visione al microscopio ottico ma troppo spesse per quella al microscopio elettronico.




La resina utilizzata in questo laboratorio ha nome "SPURR", essa è una soluzione di più composti (10 ml di VCD, 7 ml di DER, 26 ml di NSA, 0,4 ml di DMAE) che polimerizza, cioè lega i monomeri di cui è costituita e diventa solida, a 65°C e a pressione atmosferica in un tempo di 24-36 ore. L'inclusione viene fatta usando appositi stampi di plastica, ognuno contrassegnato da una lettera, nei quali i campioni vengono posti agli estremi in modo tale che sia possibile enuclearli e tagliarli in sezioni sottili utili all'osservazione.

1.4 Taglio

Il taglio dei campioni polimerizzati avviene tramite microtomi e ultramicrotomi: strumenti di alta precisione dotati di lama di vetro o di diamante su cui il campione si muove perpendicolarmente   dall'alto al basso con moto uniforme. L'avanzamento della lama è causato da una ventola munita di dispositivo termico che con il calore si dilata. Per questo motivo i microtomi sono molto sensibili al calore esterno e il loro uso deve avvenire a temperature inferiori ai 20°C.

Le lame di vetro vengono usate per sezionare i campioni da    osservare al microscopio ottico (circa 1mm di spessore, sezioni semifini); per l'osservazione al microscopio elettronico occorre invece fare uso della lama di diamante che permette di ottenere sezioni più fini, adatte a questo strumento (70-80 nm).

In entrambi i casi le fette del preparato, raccolte nella vaschetta d'acqua creata attorno alla lama, viste attraverso un apposito microscopio appaiono colorate; ogni colore è caratteristico di un certo spessore e quindi, utilizzando un'apposita legenda, lo si può riconoscere.

Per raccogliere le sezioni, si utilizza un piccolo stecco di legno con un estremo appiattito per quelle più spesse (ottenute con la lama di vetro) e un pelo sostenuto da una pinzetta o direttamente una griglia di rame, per quelle più fini (ottenute con la lama di diamante) [Fig.1].

1.5 Colorazione

Le sezioni semifini vengono osservate al microscopio ottico: si pongono le sezioni ottenute col microtomo su un vetrino portaoggetti ricoperto da una goccia d'acqua, si mette quest'ultimo su una piastra elettrica ad una predeterminata temperatura: sulle fette asciutte ed attaccate al vetrino si deposita una goccia di una soluzione di Blu di Toluidina all'1% di borato di sodio. Con questa prima colorazione ci si assicura che le sezionature del campione siano avvenute correttamente e permettano una buona visione del preparato. Il passo successivo è quello della visione al microscopio elettronico: si pongono le sezioni ultrasottili su dei piccoli supporti metallici circolari (griglie) e li si immerge in una soluzione colorante a base di sali di metalli pesanti ("Reynolds": sali di uranio e piombo).







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